生物實驗室利用液氮罐進行大鼠肝S9的制備和蛋白含量的精確測定

1 實驗目的
學會大鼠肝S9的制備及其蛋白含量的測定。

2 實驗材料與方法查特液氮罐
2.1實驗動物
大鼠：健康、雄性、成年，SD或Wistar ，5~6 周 齡，150g左右
2.2試劑
1.17% （0.15M） KCl鈉、鈉、多氯聯苯、β-萘黃酮    
Tris-HCl緩沖液：6.05g Tris加約800ml蒸餾水溶解，用HCl溶液調pH值至7.4，*后用蒸餾水定容至1000ml
2.3器材
低溫高速離心機、潔凈工作臺、勻漿器、注射器、手術剪、低溫冰箱、液氮罐等
2.4 實驗操作
2.4.1試劑的配制
（1）Tris-HCl緩沖液：6.05g Tris加約80ml蒸餾水溶解，用HCl溶液調pH值至7.4，*后用蒸餾水定容至1000ml
（2）考馬斯亮蘭G-250染料：稱100mg考馬斯亮蘭G-250，溶于50ml 95％的乙醇后，再加入120ml 85％的磷酸，用蒸餾水稀釋至1升，濾紙過濾。
2.4.2肝S9的制備
（1）誘導   鈉80mg/kg， 腹腔注射，連續3～5d，*后一次給藥后24h后采樣。
（2）采樣   采樣前禁食24h，但可以自由飲水；斷頭處死；無菌取出肝臟，置平皿中稱重，用預冷的0.15M  KCl溶液淋洗數次，以便除去能抑制微粒體酶活性的血紅蛋白。
（3）肝勻漿的制備   棄去淋洗液，將肝臟轉入小燒杯，加 Tris-HCl緩沖液溶液     3mL/g （肝濕重），轉入冰浴，用剪刀剪碎肝臟，轉入勻漿器勻漿。
（4）制備S9    將肝勻漿于低溫高速離心機0～4℃ 000g  離心  10min上清液即為S9。
（5）分裝保存   將制備好的S9于無菌冷凍管或安瓿中保存，每個安瓿2mL左右。于液氮罐速凍后置-80℃低溫保存。深低溫或冰凍干燥，保存期不超過一年。

2.5蛋白含量測定（考馬斯亮蘭染色法）
2.5.1測定原理
 考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質（主要是堿性氨基酸，特別是精氨酸和芳香族氨基酸殘基）結合，使染料的**吸收峰的位置，由465nm變為595nm，溶液的顏色也由棕黑色變為藍色。染料在595nm下測定的吸光度值與蛋白質濃度成正比。查特液氮罐
2.5.2特點
（1）靈敏度高，比Lowry法約高四倍，其*低蛋白質檢測量可達0.5 mg
（2）測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質結合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時內保持穩定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩定性**。
（3）干擾物質少。如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測定法。
2.5.3試劑與器材
試劑：
標準蛋白質溶液：1mg/ml牛血清清蛋白（BSA）
考馬斯亮蘭G-250染料試劑：稱100mg考馬斯亮蘭G-250，溶于50ml 95％的乙醇后，再加入120ml 85％的磷酸，用蒸餾水稀釋至1升，濾紙過濾。
Tris-HCl緩沖液： 6.05g Tris加約80ml蒸餾水溶解，用HCl溶液調pH值至7.4，*后用蒸餾水定容至1000ml（0.05M）
2.5.4操作方法
微量法制定標準曲線
按下表加樣，混勻，室溫靜置5-10min，以0號試管為空白對照，于595nm處比色測定吸光度，平行測定三次。95nm處吸光度為縱坐標，標準蛋白含量為橫坐標，在坐標紙上繪制標準曲線。

表一：測定標準曲線的試樣
樣品編號    0    1    2    3    4    5    6
標準血清溶液（ug）
標準血清溶液（ml）
蒸餾水（ml）    0
0
0.1    10
0.01
0.09    20
0.02
0.08    40
0.04
0.06    60
0.06
0.04    80
0.08
0.02    90
0.1
0
考馬斯亮蘭試劑（ml）    5.0

肝S9蛋白質濃度的測定
測定方法同上，分別取肝S9組分10倍稀釋液20mL、30mL、40mL，按下表加樣，測595nm的吸光度值，平行測定三次。根據所測定的平均值，在標準曲線上查出其相當于標準蛋白的量，從而計算出未知樣品的蛋白質濃度(mg/mL)。

表二：待測蛋白的試樣
樣品編號    0    1    2    3
上清液（ml）
蒸餾水（ml）    0
0.1    0.02
0.08    0.03
0.07    0.04
0.06
考馬斯亮蘭試劑（ml）                   5.0

3 實驗結果
表三：準曲線管的吸光度值
試樣    1          2         3         4           5         6  
一    0.012    0.087      0.209     0.330      0.465      0.630
二    0.062    0.084      0.245     0.360      0.472      0.600
三    0.085    0.100      0.258     0.380      0.445      0.620
平均值    0.053    0.090      0.237     0.357      0.461      0.617

圖一：蛋白質濃度和吸光度的標準曲線圖
 

 表四： 稀釋液樣品吸光度值
試樣    1                2            3       
一    0.255    0.439        0.520   
二    0.208    0.280        0.466   
三    0.195    0.435        0.690   
平均值    0.220    0.385        0.559  

利用軟件讀出稀釋液樣品的蛋白分別為0.038、0.066、0.095。
算出三次取樣的上清液濃度分別為19 mg/ml、22 mg/ml、24 mg/ml，取平均值得蛋白質的濃度為21.7 mg/ml。液氮罐

4討論
肝臟微粒體中含有多種酶系統,是許多藥物、殺蟲劑、除草劑、污染物及食物添加劑等外源性高脂溶性物質在體內的主要生物轉化場所,也稱為肝微粒體藥物代謝酶,簡稱為肝藥酶。該酶系統底物面廣,活性個體差異大,影響活性因素多。其中*重要的是混合功能氧化酶系統,可催化許多不同型的氧化反應,如羥基化,烷基化,脫氨基化,脫鹵素,硫原子氧化等。該酶系統中一個主要成分是細胞色素P450,是由與一氧化碳結合后,在光譜450nm處有吸收峰而得名。細胞色素P450含量高低反映了混合功能氧化酶系統活性的高低,這個系統將分子氧中一個氧原子氧化藥物,另一個氧原子生成水,沒有產生相應的還原物,故也稱為細胞色素單加氧酶。肝S9主要存在于肝細胞內質網中，是一個酶系統。
    肝微粒體酶的制備需在無菌條件下操作，制備之后要用液氮速凍后置-80℃低溫保存。凍干法是生物化學、生物制劑和微生學用以保持某些蛋白質、酶類和原核生物活性的較好方法之一。保持肝的代謝活性, 實質上就是要保持肝內微粒體膜上的酶類的活性。因此, 用凍干法保持肝的代謝活性。本次實驗過程肝S9制備好以后直接用于測定因此沒有進行凍干儲存的步驟。查特液氮罐